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小麥粉破損澱粉測定法α-澱粉酶法

來源: http://www.cnqlx.net  類別:相關標準  更新時間:2007-08-09  閱讀
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1主題內容與適用範圍

本標準規定了用α-澱粉酶測定小麥粉破損澱粉值的原理使用的試劑、儀器、分析的步驟以及結果計算。

本標準適用於小麥粉破損澱粉值的測定。

2方法原理

小麥粉中破損澱粉對α-澱粉酶的敏感性大大高於未破損澱粉,在常溫下能被α-澱粉酶降解生成糊精和一定量的還原糖。利用此特性,在規定的條件下,用α-澱粉酶降解小麥粉中破損澱粉,再用鐵氰化鉀法測定其還原糖量,並根據法蘭德的經驗公式計算小麥粉中的破損澱粉值。

3試劑

以下試劑未經標明的均為分析純試劑,水為蒸餾水。

3.1緩衝溶液

溶解4.1g無水乙酸鈉於水中,加入3mL冰乙酸,再用水稀釋至1000mL,pH值應為4.7±0.1。

3.2提取溶液

將20g氯化鈉及0.2g乙酸鈣溶於水中,再稀釋至1000mL。

3.3α-澱粉酶液

稱取活性相當於15000±1500A的α-澱粉酶製劑溶於500mL提取液中,再加入500mL緩衝液,α-澱粉酶活性測定見附錄A(補充件)a-澱粉酶活性測定。此溶液用時現配。

3.410%(V/V)硫酸溶液。

3.512%鎢酸鈉溶液。

3.60.1M堿性鐵氰化鉀溶液

稱取32.9g幹燥純淨的鐵氰化鉀與44.0g無水碳酸鈉溶於1000mL水中,貯於棕色瓶避光保存。

3.7乙酸鹽溶液

70g氯化鉀和40g硫酸鋅溶於水中,加入200mL冰乙酸,再用水稀釋至1000mL。

3.810%碘化鉀溶液。

3.91%澱粉溶液。

3.100.1M硫代硫酸鈉溶液

稱取24.82g硫代硫酸鈉(含5個結晶水)和3.8g四硼酸鈉溶於1000mL水中,貯於棕色瓶避光保存,一星期後按GB5490《糧食、油料和植物油脂檢驗一般規則》附錄B規定方法標定其濃度。

3.11酸洗石英砂。

4儀器和用具

4.1玻璃試管:φ25×220mm。

4.2量筒:50mL;25mL。

4.3恒溫水浴:可控溫30±0.1。

4.4秒表。

4.5加液器或移液管:2mL;10mL。

4.6移液管:5mL。

4.7玻璃漏鬥及中速濾紙。

4.8電爐。

4.9錐形瓶:100mL。

4.10滴定管:10mL。

4.11天平:感量0.01g;0.1mg。

4.12pH計或精密pH試紙:可測pH4.7±0.1。

5分析步驟

5.1稱樣量

一般小麥粉均假定其水分含量為14.0%,澱粉含量為68%-72%,稱樣量為1.000.01g。如果澱粉含量過高或過低時,則稱樣量應按式(1)計算:

70

稱樣量(g)=-----------

(95-p-M)

式中:P——100g試樣中蛋白質的克數(含氮量×5.7);

M——100g試樣中水分的克數。

5.2酶解

稱取5.1規定量的試樣於玻璃試管中,加入1小勺酸洗石英砂,混勻並將試樣搖鬆傾斜於試管底部,準確量取46mL已預熱至30℃的α-澱粉酶液,先將少許α-澱粉酶液加入試樣中並盡量搖勻,立即計時,再加入其餘α-澱粉酶液,加蓋試管並上下顛倒搖動約30次使試樣均勻懸浮。迅速將試管浸入30℃水浴中,然後每隔10min取出試管,上下顛倒搖動10次使試樣重新均勻懸浮,恒溫酶解剛好60min時,取出試管,立即加入2mL10%硫酸溶液,充分混勻後,再加入2mL12%鎢酸鈉溶液,搖勻並放置約2min後,用中速濾紙過濾。充去最初幾滴,收集濾液於幹淨錐形瓶中,此濾液即為試樣測定液。另取一支試管不加小麥粉試樣,同時同上操作,所得濾液即為空白對照液。

5.3測定還原糖

準確吸取5mL試樣液於試管中,再準確加入10mL0.1M堿性鐵氰化鉀溶液,混合後將試管浸入劇烈沸騰的水中(可將試管置於鐵絲籠架放入鋁鍋煮沸的水中,每次可同時作多個樣品的測定),繼續加熱待水再沸騰後開始計時,準確反應20min後,取出試管立即置流水冷卻。冷卻後將試管中溶液倒入錐形瓶中,並用25mL乙酸鹽溶液分三次洗滌試管一並倒入錐形瓶內,再加入10ml10%碘化鉀溶液。然後用0.1M硫代硫酸鈉溶液滴定至淡黃色,再加入約1mL1%澱粉液,繼續滴定至溶液藍色消失(半分鍾內溶液不返藍色),記錄用去硫代硫酸鈉溶液的體積為V1(mL)。吸取空白對照液5mL代替試樣液,同上操作,記錄用去硫代硫酸鈉溶液的體積為V2(mL)。

6結果計算

6.1氧化5mL樣品液(相當於0.1g小麥粉樣品)中還原糖所需0.1M鐵氰化鉀體積V按式(2)計算;

c

V=(V2-V1)×---………………………………(2)

0.1

式中:V——氧化試樣液中還原糖所需的0.1M鐵氰化鉀液的體積,mL;V1——滴定試樣液用去硫代硫酸鈉的體積,mL;V2——滴定空白液用去硫代硫酸鈉的體積,mL;c——硫代硫酸鈉的摩爾濃度,M;0.1——換算成0.1M鐵氰化鉀溶液體積的係數。6.2小麥粉麥芽糖值的確定根據式(2)計算所得V值在表1中用插入法查出相應的100g小麥粉中含有麥芽糖的克數,即為該樣品的麥芽糖值L。

6.3小麥粉破損澱粉值(P)按式(3)計算:

P=(5×L-3.5)×6………………………………(3)式中:L——小麥粉麥芽糖值。

7結果允許差

兩次測定結果之差不得超過平均值的5%,測定結果保留小數點後一位。

附錄A

α-澱粉酶活性的測定

(補充件)

A1主題內容和適用範圍

本補充件規定了用比色法測定α-澱粉酶活性的方法。

本補充件適用於各種來源的α-澱粉酶製劑及穀類產品的α-澱粉酶活性的測定。

A2方法原理

α-澱粉酶能降解--限製糊精,經過不同的反應時間後,反應混合物與碘的顯色強度隨時間增加而降低,用測定這種顯色強度隨時間降低的速度來反映α-澱粉酶的活性。

A3試劑

以下試劑未經標明的均為分析純,水為蒸餾水。

A3.10.2%氯化鈣溶液。

A3.2碘貯備液

溶解11.0g碘化鉀於少量水中,加入5.5g結晶碘,攪拌至碘完全溶解,再稀釋至250mL,置棕色瓶中貯於暗處。此液可保存一個月。

A3.3碘稀釋液

溶解40.0g碘化鉀於水中,加入4.0mL碘貯備液,用水稀釋至1000mL,用時現配。

A3.4緩衝溶液

溶解164g無水乙酸鈉或272g三水乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)於水中,加入120mL冰乙酸,用水稀釋至1000mL。

A3.5可溶性澱粉。

A3.6β-澱粉酶液

取10g具有酶活性的新鮮黃豆粉(粗細度為通過15mm孔篩的篩下物)於燒杯中,加入85mL水和15mL0.05M硫酸溶液,充分攪勻,靜置15min後,用中速濾紙過濾,該濾液用於製備β--限製糊精。

A3.70.05M硫酸溶液。

A3.8β--限製糊精

稱取5.00g(以幹態計)可溶性澱粉於小燒杯中,加入約20mL水,攪拌使成懸浮液,然後將懸浮液邊攪拌邊緩慢倒入盛有約100mL沸騰水的高型燒杯中,並用洗瓶將小燒杯中澱粉全部轉移至高型燒杯,繼續攪拌並加熱使緩慢沸騰2min,然後用表麵皿蓋上燒杯口,取出用流水冷卻,再加入25mL緩衝溶液及50mLα-澱粉酶液,在室溫下,放置24h後,加入一匙浮石粉,在10min內緩慢加熱至沸,保持沸騰5min後,取出流水冷卻,最後用水定容至250mL,搖勻、過濾,濾液中加幾滴甲苯,在25℃以下貯存5天,此溶液的pH須在4.7±0.1。

A4儀器和用具

A4.1玻璃試管。

A4.2高型燒杯:250mL。

A4.3容量瓶:250mL;100mL。

A4.4玻璃漏鬥:φ6cm。

A4.5表麵皿:φ7cm。

A4.6移液管:2mL;5mL;15mL。

A4.7量筒:25mL;50mL。

A4.8加液器或移液管:10mL。

A4.9電爐:1000W。

A4.10恒溫水浴:可控溫30±0.1℃及20±0.5℃。

A4.11秒表。

A4.12實驗磨粉機。

A4.13篩子:孔徑為1.0mm及0.8mm。

A4.14pH計或精密pH試紙:可測pH4.7±0.1

A4.15分光光度計。

A5分析步驟

A5.1α-澱粉酶溶液的配製

A5.1.1酶製劑α-澱粉酶液的配製

稱取α-澱粉酶製劑48mg,用0.2%氯化鈣溶液溶解並稀釋至100mL。根據該溶液酶活性的大小再用0.2%氯化鈣稀釋至適合於測定活性的溶液,稀釋後的溶液應使35%-60%的限製糊精在15-40min內被降解,即最後測得的吸光度值應為底物校準時吸光度值的40%-65%。

A5.1.2麥芽粉及其他產品α-澱粉酶液的配製

測定麥芽粉可稱樣100g,如測定其他產品,則根據酶活性的大小擬定稱樣量,均按下述步驟提取酶液。

將預先在30℃水浴中恒溫10min以上的0.2%氯化鈣溶液100±0.5mL加入試樣中,加塞振搖使充分混合,立即置於30℃水浴中,每隔15min取出試管,上下顛倒混合10次,再浸入水浴(振搖次數與程度對結果有影響),恒溫提取60min後取出過濾(不要振搖),此濾液即為酶提取液。

A5.2底物的校準

A5.2.1混合5mLβ—限製糊精及15mL0.2%氯化鈣溶液於燒杯中。

A5.2.2在試管中先加入10mL稀釋碘液,再加入A5.2.1的混合液2mL,然後用適量的水稀釋(一般稀釋水量為20-40mL之間),混合後在20℃下用1cm比色杯在波長575nm下測其吸光度。

A5.2.3調整原稀釋水量再按A5.2.2操作,反複多次直至測得的吸光度值在0.55-0.6之間,記錄此時稀釋水量V(mL),即為該底物的校正水量。

A5.2.4在另一支已加入10mL稀釋碘液的試管中,加入2mL0.2%氯化鈣液代替混合液,同A5.2.2操作,作為A5.2.2測定吸光度時的空白對照。

A5.3α-澱粉酶活性測定

A5.3.1將待用--限製糊精預熱至30℃。

A5.3.2吸取A51稀釋後的酶液15mL於試管中,置30水浴恒溫5!10min。

A5.3.3用速流移液管吸取5mL已預熱的--限製糊精迅速加入含15mL酶液的試管中,在加入糊精的同時立即用秒表計時,然後分別在30恒溫10min和30min時吸取此混合液,按下述操作。

A5.3.4吸取2mL上述混合液立即加入預先加入10mL稀釋碘液的試管中,再加入

A5.2.3測得的水的體積V(mL)(即校正水量),混勻後在20下恒溫,並用1cm比色杯在波長575nm下測定吸光度(如測定一係列樣品,可在所有樣品均完成顯色後再一起測定吸光度,但最長間隔時間不得超過1h)。

A5.3.5用2mL0.2%氯化鈣溶液代替混合液,同A5.3.4操作,作為A5.3.4測定吸光度時的空白對照。

A5.3.5用2mL0.2%氯化鈣溶液代替混合液,同A5.3.4操作,作為A5.3.4測定吸光度時的空白對照。

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